« mars 2024 »
L M M J V S D
26 27 28 29 1 2 3
4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15 16 17
18 19 20 21 22 23 24
25 26 27 28 29 30 31
 
Tous les évènements de Physique à venir

Tous les évènements de Biologie / Chimie à venir

Tous les évènements à venir

Les évènements relevant de la Physique et de la Biologie / Chimie sont représentés en turquoise

Mécanismes moléculaires de la perception de la température ambiante chez les plantes

Jeudi 28 mars 2019 14:00 - Duree : 2 heures
Lieu : Salle du bâtiment accueil, CEA - 17 rue des Martyrs - Grenoble

Orateur : Soutenance de Thèse de Aditya NAYAK (IRIG/DBSCI/PCV)

Résumé :

Le Complex Evening (EC, Evening complex) est composé de trois protéines : EARLY FLOWERING 3 (ELF3), ELF4 et LUX ARRYTHMO (LUX). Ce complexe est un composant clé de l’horloge circadienne de la plante et un important régulateur de gènes impliqués dans la croissance de la plante en réponse à la température, comme PHYTOCHROME INTERACTING FACTEUR 4 (PIF4) notamment. Des études ont montré que l’activité de ce complexe dépend de la température, avec une activité répressive qui augmente à des températures plus basses. Pour autant les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation du complexe EC, dans sa liaison à l’ADN et son activité thermosensible étaient encore très mal compris. Une série d’expériences structurales in vitro, et in planta ont été réalisées afin de mieux comprendre l’ensemble de ces mécanismes moléculaires.

Pour cela, les trois protéines recombinantes du « EC » ont été produites et purifiées jusqu’à homogénéité. Ces protéines ont été utilisées pour reconstituer le complexe in vitro et pour étudier son activité de liaison à l’ADN. Le rôle des trois protéines dans la formation et l’activité du complexe ont été déterminé. LUX est nécessaire à la liaison à l’ADN via son domaine MYB , et cible le EC vers ses sites de liaison. ELF3 agit comme un échafaudage pour la formation du EC en liant à la fois LUX et ELF3. Cependant, le complexe LUX-ELF3 ne se lie pas avec une haute affinité à l’ADN. ELF4 est nécessaire pour rétablir la liaison de l’ADN au complexe. Pour explorer davantage les déterminants de la spécificité de liaison à l’ADN, le domaine de liaison à l’ADN (DBD) de LUX a été exprimé, purifié et cristallisé. La structure cristalline de LUX DBD en complexe avec deux oligonucléotides d’ADN différents, révèle les acides aminés critiques pour la liaison à l’ADN. La majorité de ces résidus entrent en contact avec le sillon principal de l’ADN et font partie d’un motif spécifique à la plante SH (A / L) QK (F / Y). De plus, un résidu d’arginine (Arg146) dans la région flexible N-terminale de la protéine joue un rôle important avec des contacts dans le sillon mineur de l’ADN. Sur la base de ces études structurales, une mutation de l’arginine en alanine (R146A) a été réalisée. Cette mutation diminue l’affinité de liaison à l’ADN mais conserve la spécificité déterminée in vitro par des expériences de gels de retard en comparaison avec la protéine de type sauvage. Des expériences transgéniques ont été utilisées pour déterminer l’effet de la mutation R146A chez la plante. Comme prévu, cette mutation a abouti à un phénotype intermédiaire entre le type sauvage et un mutant « knock out » du EC. Ceci suggère qu’en modifiant l’affinité de LUX pour sa liaison à l’ADN, l’activité de la totalité du EC peut être ajustée dans la plante. L’expression de PIF4 chez le mutant R146A est plus élevée que chez le sauvage mais moins affectés que chez le mutant lux, ce qui confirme la diminution de l’activité répressive du EC par la mutation R146A de LUX.

Pour explorer plus en profondeur la régulation du gène PIF4, la technologie CRISPR-Cas9 a été utilisée pour cibler différents éléments cis de son promoteur, notamment le site de liaison de LUX (LBS) et un élément qui s’appelle une « G-box » . Ces mutations ont entraîné des effets opposés sur la croissance des plantes et leur réponse à la température. Le mutant dans le LBS présente des hypocotyles allongés et un phénotype de floraison précoce à 22 ° C par rapport au sauvage, alors que le mutant de « G-box » entraine un raccourcissement des hypocotyles et une floraison tardive à 27 ° C par rapport au sauvage. Cela suggère qu’une modification des éléments cis dans le promoteur de PIF4 pourrait être un moyen de reprogrammer la croissance des plantes et leur réponse à la température.

Ces résultats fournissent différentes stratégies pour influer sur la croissance des plantes sous différents régimes de température ambiante sans contrainte de stress, que ce soit par l’ingénierie des protéines basée sur la structure, comme indiqué pour la mutation LUX R146A ou par l’édition génomique d’éléments de régulation spécifiques connus pour affecter la croissance et la réponse à la température tels que LBS et G-box dans le promoteur de PIF4. Avec l’augmentation des températures due au changement climatique et à ses effets néfastes sur la productivité des plantes, la capacité de modifier de manière prévisible la croissance des plantes et leur réponse à la température constituent un moyen intéressant de relever ce défi mondial. Ces résultats constituent une base potentielle pour de futures applications en bio-ingénierie d’espèces cultivées.

Abstract :

The Evening Complex (EC), a three protein complex comprising EARLY FLOWERING 3 (ELF3), ELF4 and LUX ARRYTHMO (LUX), is a key component of the plant circadian clock and an important regulator of genes important for thermosensitive growth, including PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR 4 (PIF4). Studies have shown that EC activity is temperature dependent, with increased repressive activity at lower temperatures. However, the molecular mechanisms for EC complex formation, DNA-binding and thermosensitive activity were not known. In order to address this, a series of in vitro, structural and in planta experiments were performed.

All three proteins of the EC were recombinantly produced and purified to homogeneity. These proteins were used to reconstitute the EC in vitro and to study its DNA-binding activity. The role of all three proteins in complex formation and activity were determined. LUX acts as the driver of DNA-binding via its MYB DNA-binding domain and targets the EC to its cognate sites. ELF3 acts as a scaffold for EC formation by binding both LUX and ELF3. However, the LUX-ELF3 complex poorly binds to DNA. ELF4 is required to restore DNA-binding of the complex. To further explore the DNA-binding specificity determinants, the DNA-binding domain (DBD) of LUX was expressed, purified and crystallized. The crystal structure of the LUX DBD in complex with two different DNA oligonucleotides reveals the residues critical for base read-out. The majority of these residues contact the major groove and are part of a plant-specific signature motif SH(A/L)QK(F/Y). In addition, an arginine residue (Arg 146) in the flexible N-terminal region of the protein acts as a clamp with contacts in the minor groove. Based on these structural studies, an arginine to alanine mutation (R146A) was made which had decreased DNA-binding affinity but retained specificity as determined in vitro via band shift assays as compared to the wild type protein. Transgenic experiments were used to determine the effect of the R146A mutation in planta. As predicted, this mutation resulted in a phenotype between wild type and an EC knock out mutant. This suggests that by altering the DNA binding affinity of LUX, the activity of the entire EC can be tuned in the plant. PIF4 expression levels were measured in the mutant and were shown to be elevated with respect to wild type but less affected than in a lux mutant, further supporting the decreased repressive activity of the EC due to the R146A mutation in LUX.

To further explore PIF4 regulation, CRISPR-Cas9 was used to target different cis-elements in the PIF4 promoter including the LUX Binding Site (LBS) and a G-box element. These mutations had opposite effects on plant growth and thermoresponse with the LBS mutant exhibiting elongated hypocotyls and an early flowering phenotype at 22°C as compared to wt. The G-box mutant on the contrary exhibited shortened hypocotyls and a late flowering phenotype at 27°C as compared to wt. This suggests that altering cis-elements in the PIF4 promoter may be a way to reprogram plant growth and thermoresponse at different temperatures.

Taken together, these results provide different strategies to affect plant growth under different non-stress ambient temperature regimes through either structure-based protein engineering as shown for LUX R146A mutation or via genome editing of specific regulatory elements known to affect growth and thermoresponse such as the LBS and G-box in the PIF4 promoter. With the increase in global temperatures due to climate change and the deleterious effects this has on crop productivity, the ability to predictably alter plant growth and thermoresponse is an attractive way to address this global challenge. These results provide a potential foundation for future applications in bioengineering of important crop species.

Contact : odile.rossignol@cea.fr

Discipline évènement : (Biologie / Chimie)
Entité organisatrice : (CEA / IRIG)
Nature évènement : (Soutenance de thèse)
Site de l'évènement : Site CEA sans badge requis

Prévenir un ami par email

Télécharger dans mon agenda

Cafés sciences de Grenoble | UdPPC de Grenoble | Sauvons Le Climat | Cafe des sciences de Vizille
Accueil du site | Secretariat | Espace privé | Suivre la vie du site RSS 2.0 : Tous les evenements Suivre la vie du site RSS 2.0 : Evenements de Physique Suivre la vie du site RSS 2.0 : Evenements de Biologie & Chimie