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Caractérisation biochimique et cellulaire des récepteurs PROKR1 et PROKR2 et criblage structural de leur ligand PROK1 : Intérêt pour les pathologies PROK1-dépendantes

Vendredi 24 mars 2023 14:00 - Duree : 2 heures
Lieu : Salle de séminaire 445, bâtiment 1005, CEA Grenoble

Orateur : Soutenance de Thèse de Kévin GEMY (IRIG/BIOSANTE)

Persons who do not have a CEA badge must request an entry authorization sufficiently in advance, before March 17, contact : Mohamed Benharouga

Résumé :

Le facteur, PROK1 aussi dénommé EG-VEGF appartient à la famille des prokinéticines (PROK), dont les membres sont directement impliqués dans le contrôle de l’inflammation et l’angiogenèse. Ces facteurs agissent via deux récepteurs de la famille des RCPG, PROKR1 et PROKR2 et régulent plusieurs processus physiologiques et pathologiques, y compris le cancer. Mon équipe de recherche a récemment démontré que l’expression de PROK1 et PROKR2 était augmentée dans le cancer du système reproducteur féminin, le choriocarcinome gestationnel (CG), et dans la mucoviscidose. L’antagonisation de PROKR2 dans un modèle animal de CG diminue le développement et la progression de ce cancer et réduit la réponse inflammatoire, suggérant que l’inhibition du système PROK1/PROKR2 pourrait constituer une cible thérapeutique prometteuse pour les cancers et les pathologies pro-inflammatoires PROK1-dépendantes. Cependant, les antagonistes anti-PROKR2 ne sont pas spécifiques pour ce récepteur, présentent une toxicité à long terme et peuvent être associés au développement d’effets secondaires, car ils bloquent un récepteur partagé avec d’autres membres de la famille des PROK. Ainsi, les objectifs de ma thèse étaient, i) de développer une nouvelle stratégie d’inhibition de ce système en ciblant le ligand, PROK1, et ii) de mettre en évidence les différences moléculaires et cellulaires qui caractérisent les récepteurs PROKR1 et PROKR2 afin de proposer, à long terme, des stratégies thérapeutiques ciblant spécifiquement l’un ou l’autre récepteur. Le développement de la stratégie du blocage du ligand PROK1 a nécessité, le clonage de la séquence humaine de prok1 dans différents plasmides, la mise en place de plusieurs systèmes « eucaryotes ou procaryotes » d’expression et de production, et le développement de nombreuses techniques de purification afin de résoudre sa structure tridimensionnelle (STD). Des analyses in silico ont également été réalisées ; pour accélérer la résolution de sa STD, caractériser les interfaces de son interaction avec PROKR2, et réaliser le docking moléculaire dans le but d’identifier des molécules chimiques capables d’inhiber l’interaction PROK1-PROKR2. Un test fonctionnel a aussi été développé pour évaluer in vitro les molécules les plus prometteuses. Pour la réalisation de ce test fonctionnel, nous avons généré deux lignées stables exprimant PROKR1 ou PROKR2. La caractérisation cellulaire et moléculaire de PROKR1 et PROKR2 a mis en évidence l’existence de différences post-traductionnelles concernant les demi-vies des récepteurs, leur stabilité, leur mode d’adressage à la membrane et leurs niveaux de repliement. Partant de ce constat, nous avons débuté l’étude des mécanismes sous-jacents à ces différences en ciblant prioritairement les extrémités N- et C-ter et leurs implications dans le processus de dimérisation potentielle de PROKR1 et PROKR2. L’ensemble des résultats de ma thèse ont permis de produire la protéine PROK1, de résoudre sa structure et d’identifier les acides aminés impliqués dans son interaction avec le PROKR2. Le développement des lignées exprimant PROKR1 ou PROKR2 a permis,

i) de mettre en place un test fonctionnel de l’activité des prokinéticines,

ii) d’identifier trois molécules inhibitrices du ligand PROK1 et,

iii) de démontrer qu’en dépit de la faible différence d’identité entre PROKR1 et PROKR2, que PROKR1serait plus stable au niveau de la membrane, subirait moins de dégradation au niveau du lysosome, et que sa partie C-ter confèrerait la dimérisation entre récepteurs PROKR.

En conclusion, ma thèse a apporté des outils moléculaires pour l’étude des prokinéticines, a permis d’identifier de nouvelles molécules inhibitrices du ligand PROK1 et de son interaction avec PROKR2 et à comparer pour la première fois les deux récepteurs de cette famille. L’ensemble de ces données nous permettra de mieux cibler les récepteurs PROKR et leurs ligands afin de proposer une pharmacothérapie plus spécifique des cancers PROK-dépendants et des maladies inflammatoires dans lesquelles ils sont dérégulés, comme la prééclampsie et la mucoviscidose.

https://irig.cea.fr/drf/irig/Pages/Animation-scientifique/theses/2023_Gemy.aspx

Contact : odile.rossignol@cea.fr

Discipline évènement : (Biologie / Chimie)
Entité organisatrice : (CEA / IRIG)
Nature évènement : (Soutenance de thèse)
Site de l'évènement : Site CEA avec accès badge

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